CH04샘플러 · 컬럼 · 검출기 설정

학습 목표#

• 시료 양에 맞춰 바이알 · 셉타 캡 · 인서트를 고르고, 기포 없이 적정 높이로 채워 트레이의 위치 번호에 놓을 수 있습니다.
• 시뮬레이터의 샘플러 설정 화면에서 주입량 · 니들 세척을 정하고, 주입 밸브의 Load → Inject 동작을 애니메이션으로 따라가며 설명할 수 있습니다.
• 컬럼 라벨(충전제 · 길이 × 내경 · 입자 크기 · 최대 압력 · pH 범위)을 읽고, 유로 방향 → 입구 먼저 → 출구 순서로 장착한 뒤 30 °C 에서 평형시킬 수 있습니다.
• 비어-람베르트 법칙(A = ε·b·c)으로 흡광도와 농도 · 광로 길이의 관계를 설명하고, 분석물 흡수와 용매 UV 컷오프를 함께 고려해 검출 파장을 고를 수 있습니다.
• 램프 예열 · 피크 폭(응답 시간) · Balance(오토 제로) 를 설정하고, Python 으로 베이스라인의 노이즈 · 드리프트를 계산해 비교할 수 있습니다.

이론#

1교시 — 바이알 샘플러 설정과 컬럼 장착#

이 단원에서 할 일#

ch03 에서 이동상을 준비하고 펌프 압력이 안정되는 것까지 확인했습니다. 이제 이동상이 지나가는 길 위의 나머지 두 모듈, 바이알 샘플러(G7129A) 와 멀티컬럼 온도조절기(G7116A) 를 설정합니다. 이번 단원에서는 바이알을 준비해 트레이에 놓고, 주입량 · 니들 세척을 정한 뒤, C18 컬럼을 방향에 맞게 달고 평형(equilibration) 시킵니다. 마지막으로 Python 으로 컬럼 부피와 평형 시간을 계산합니다.

바이알 · 셉타 캡 · 인서트 고르기#

• 바이알 · 캡 · 인서트의 정확한 규격(지름 · 높이)은 트레이와 샘플러 모델이 정합니다. 실물에서는 애질런트 소모품 목록에서 G7129A 호환 제품을 확인합니다.
• 셉타를 거꾸로 끼우면 실리콘 면이 시료(특히 유기 용매)에 닿아 불순물 피크가 생길 수 있습니다.

시료를 채우는 높이와 기포 제거

1. 시료는 바이알 어깨 아래(약 2/3 ~ 3/4) 까지 채웁니다. 가득 채우면 니들이 셉타를 뚫을 때 시료가 넘치거나 압력이 생깁니다.
2. 너무 적게 채우면 니들 끝이 액면 위에 있어 공기를 빨아들입니다(주입량 부족 · 피크 면적 감소).
3. 캡을 닫은 뒤 바이알을 세워 들고 벽을 손가락으로 가볍게 톡톡 쳐서 바닥 · 벽의 기포를 위로 올립니다. 인서트는 바닥이 뾰족해 기포가 잘 걸리므로 특히 확인합니다.
4. 바이알 겉면에 시료 이름 · 날짜를 적습니다. 라벨 스티커가 두꺼우면 트레이 칸에 끼므로 얇은 라벨이나 바이알 전용 펜을 씁니다.

트레이 위치 번호와 시퀀스#

ch02 에서 본 것처럼, 시뮬레이터는 트레이를 앞줄 왼쪽부터 1, 2, 3, … 으로 번호를 매깁니다(실물 1260 의 위치 표기는 트레이 · 서랍 종류에 따라 다르므로 설명서의 트레이 그림을 확인합니다).

• 장비는 바이알의 내용을 모릅니다. 오직 위치 번호로 바이알을 찾아가 시료를 빨아들입니다.
• 그래서 나중에 시퀀스(ch05)를 만들 때 "1번 줄: 위치 1, 시료명 STD-1, 주입량 10 µL" 처럼 위치 번호와 시료 이름을 짝지어 적습니다. 바이알을 다른 칸에 놓으면 장비는 엉뚱한 시료를 엉뚱한 이름으로 기록합니다.
• 이 강좌는 위치를 다음처럼 나눠 씁니다: 1 ~ 6 시료 · 표준물, 7 세척 바이알, 그 밖은 비워 둠.

주입량 · 니들 세척과 주입 밸브 동작#

시뮬레이터의 주입량 범위는 기본 계량 장치 기준 0.1 ~ 100 µL 입니다. 실물은 장착된 계량 장치 · 루프 옵션에 따라 다르므로 설명서를 확인합니다.

한 번 주입할 때 일어나는 일 — ch02 의 주입 밸브 그림을 시간 순서로 펼친 것입니다.

1. Load: 이동상은 펌프 → 밸브 → 곧장 컬럼으로 흐릅니다. 시료 경로(니들 · 시트 · 계량 장치)는 흐름에서 떨어져 있습니다.
2. 니들 세척(설정했다면): 니들이 세척 바이알에 잠깐 담갔다가 나옵니다.
3. 흡입(draw): 니들이 정한 위치의 바이알로 가서 셉타를 뚫고, 계량 장치가 주입량만큼 시료를 빨아들입니다.
4. 니들이 니들 시트로 돌아와 꽂힙니다.
5. Inject: 밸브가 돌아가 이동상이 시료 경로를 지나며 시료를 컬럼으로 밀어 넣습니다. 이 순간이 크로마토그램의 시간 0 입니다.
6. 애질런트 바이알 샘플러는 흐름 통과(flow-through) 방식이라 분석이 끝날 때까지 이동상이 시료 경로를 계속 씻어 냅니다(ch02 팁: Inject ≈ Mainpass).

따라하기 — 바이알 놓고 주입 설정하기#

물:메탄올 70:30 이동상을 시료 대신 넣은 "바탕(blank)" 바이알 두 개와 세척 바이알 하나를 놓는다고 하겠습니다.

1. ch03 처럼 펌프가 1 mL/min 에서 ● 안정 인 상태에서 시작합니다(펌프는 켜 둡니다).
2. 상단 메뉴에서 <b>모드 › 샘플러 설정</b>(<kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>Shift</kbd>+<kbd>L</kbd>)을 고릅니다. 3D 뷰가 샘플러 앞쪽으로 확대되고 A ~ D 영역이 나타납니다.
3. <b>편집 › 바이알 준비</b>에서 바이알 2 mL 투명, 캡 스크루 + PTFE/실리콘, 인서트 없음, 시료량 1.2 mL, 시료 이름 BLANK-1 을 넣고 만들기를 누릅니다. 3D 뷰에 바이알이 손에 들린 상태로 나타납니다.
4. 3D 뷰에서 바이알을 클릭한 채 <kbd>T</kbd> 를 눌러 톡톡 치기를 합니다. 바닥의 작은 기포가 위로 올라가 사라지는 것을 봅니다.
5. 트레이 지도(A)에서 1번 칸을 더블클릭하면 바이알이 그 칸에 놓입니다. 3 ~ 5 단계를 반복해 BLANK-2 를 2번 칸에 놓습니다.
6. 같은 방법으로 시료량 1.5 mL, 이름 WASH (메탄올) 인 세척 바이알을 만들어 7번 칸에 놓습니다.
7. 주입 설정(B)에 주입량 10.0 µL, 흡입 속도 100 µL/min, 토출 속도 400 µL/min, 니들 높이 오프셋 0.0 mm, 바이알 위치 1 을 넣고 <kbd>Enter</kbd> 를 누릅니다.
8. 니들 세척(C)에서 세척 바이알을 고르고 위치 7, 담그는 횟수 1 을 넣습니다.
9. D 영역에서 한 번 주입 ▶ 을 누릅니다. 애니메이션이 Load → 세척(7) → 흡입(1) → 시트 복귀 → Inject 순서로 재생되는 것을 봅니다.
10. 다시 Load 로 돌리려면 3D 뷰에서 주입 밸브를 클릭하고 <kbd>V</kbd> 를 누릅니다. 이벤트 로그에 Injection valve: Load 가 뜹니다.

3D 시뮬레이터 열기

3D 뷰어 열기

결과 확인#

• 트레이 지도(A)에서 1 · 2 · 7번 칸이 색칠되어 있고, 마우스를 올리면 BLANK-1 · 1.2 mL 처럼 보입니다.
• 이벤트 로그가 Needle wash (vial 7) → Draw 10.0 uL from vial 1 → Injection valve: Inject 순서입니다.
• 주입 순간 펌프 제어 화면(ch03)의 압력 그래프에 아주 짧은 흔들림이 보입니다. 밸브가 돌면서 유로가 잠깐 바뀌기 때문이며 정상입니다.

컬럼 정보 읽기#

컬럼 몸통이나 상자 · 성적서(certificate)에는 다음 정보가 적혀 있습니다. 이 강좌의 시뮬레이터 기본 컬럼은 C18, 150 × 4.6 mm, 5 µm 입니다.

위 표의 최대 압력 · pH · 온도는 예시입니다. 실제 컬럼은 제조사 성적서의 값을 따릅니다(확인 필요).

컬럼 장착 순서#

1. 유로 방향 확인 — 컬럼 몸통의 화살표(→)가 열교환기 쪽에서 검출기 쪽을 가리키게 잡습니다(ch02).
2. 입구 먼저 — 열교환기 출구 캐필러리를 컬럼 입구에 연결합니다. 출구는 아직 연결하지 않습니다.
3. 낮은 유속으로 밀어내기 — 0.2 mL/min 정도로 흘려 컬럼 출구에서 방울이 일정하게 떨어지는지 봅니다. 컬럼 안의 보관 용매와 공기가 이때 빠져나갑니다. 공기를 검출기 플로셀로 보내지 않으려는 것입니다.
4. 출구 연결 — 방울이 고르게 떨어지면 펌프를 잠시 멈추고 컬럼 출구를 검출기 플로셀 입구 캐필러리에 연결합니다.
5. 유속을 단계적으로 — 0.2 → 0.5 → 1.0 mL/min 으로 올리며 압력이 매끄럽게 따라 오르는지 봅니다. 한 번에 올리면 압력 충격이 생깁니다.
6. 온도 설정 · 문 닫기 — 컬럼 온도를 정하고 온도조절기 문을 끝까지 닫습니다.

컬럼 온도 설정#

• 온도조절기는 이동상을 열교환기에서 먼저 데운 뒤 컬럼에 넣습니다. 그래서 실온이 바뀌어도 머무름 시간이 흔들리지 않습니다.
• 이 강좌는 30 °C 를 씁니다. 실온보다 조금 높게 잡아야 온도조절기가 "데우는 쪽"으로만 제어해 안정됩니다.
• 온도가 오르면 이동상 점도가 줄어 압력이 낮아지고 머무름 시간이 짧아집니다. 그래서 온도가 설정값에 도달한 뒤에 평형을 판단합니다.
• 실물 G7116A 의 설정 범위 · 승온 속도는 사용자 설명서를 확인합니다(확인 필요). 시뮬레이터는 실온 25 °C 에서 30 °C 까지 약 5분 걸리게 만들었습니다.

컬럼 평형 — 얼마나 흘려야 하나#

평형(equilibration)은 컬럼 충전제 표면이 지금 흐르는 이동상과 완전히 같은 상태가 되도록 충분히 흘리는 일입니다. 평형이 덜 되면 머무름 시간 · 베이스라인이 분석 내내 움직입니다.

• 기준: 보통 컬럼 부피(column volume)의 10배 이상을 흘립니다. 이동상 조성이 크게 바뀌었거나 첨가제가 있으면 더 흘립니다.
• 컬럼 부피(V₀, 빈 공간 부피) ≈ π · r² · L · ε — r 은 내경의 절반, L 은 길이, ε 은 충전층에서 용매가 차지하는 비율(전체 공극률, 다공성 실리카 컬럼은 대략 0.6 ~ 0.7).
• 150 × 4.6 mm 컬럼: 빈 관 부피 = π × 0.23² × 15 ≈ 2.49 mL, ε = 0.65 이면 V₀ ≈ 1.6 mL. 10배는 약 16 mL 이므로 1 mL/min 에서 약 16분입니다.
• 계산 시간만 믿지 않고, 압력과 베이스라인이 둘 다 안정한지 화면으로 확인합니다.

따라하기 — C18 컬럼 장착과 평형#

1. 펌프를 끕니다(<kbd>F9</kbd>). 컬럼을 연결 · 분리할 때는 항상 흐름을 멈춥니다.
2. <b>모드 › 컬럼 · 온도</b>(<kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>Shift</kbd>+<kbd>H</kbd>)를 고릅니다. 3D 뷰가 온도조절기 문을 연 상태로 확대됩니다.
3. 왼쪽 컬럼 보관함에서 C18 150 x 4.6 mm 5 um 을 고르고 <b>정보 보기</b>(<kbd>I</kbd>)로 라벨의 최대 압력 · pH 범위를 확인합니다.
4. 컬럼을 끌어 컬럼 클립 위에 놓습니다. 화살표가 반대이면 놓기 전에 <kbd>R</kbd> 로 앞뒤를 뒤집습니다. 놓은 뒤 화살표가 열교환기 → 검출기 쪽인지 다시 봅니다.
5. 열교환기 출구 캐필러리 끝을 끌어 컬럼 입구에 놓습니다. 로그에 Column inlet connected 가 뜹니다.
6. 펌프 제어(<kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>Shift</kbd>+<kbd>F</kbd>)에서 유속 0.2 mL/min 을 넣고 펌프를 켭니다(<kbd>F9</kbd>). 3D 뷰에서 컬럼 출구 끝에 방울이 떨어지는 것을 확인합니다.
7. 방울이 고르게 떨어지면 펌프를 끄고, 검출기 쪽 캐필러리(ST 0.12 × 280) 끝을 끌어 컬럼 출구에 놓습니다. 로그에 Column outlet connected.
8. 컬럼 · 온도 화면에서 온도 30.0 °C 를 넣고 <kbd>Enter</kbd>, 3D 뷰에서 문을 클릭해 닫습니다(로그 Door closed).
9. 펌프를 켜고 유속을 0.5 → 1.000 mL/min 으로 30 s 쯤 간격을 두고 올립니다. 최대 압력 한계는 컬럼 한계보다 낮은 350 bar 로 정합니다.
10. 온도가 30.0 °C 에 도달하고, 펌프 압력이 ● 안정 이 될 때까지 기다립니다. 상태 막대의 평형 진행률(흘린 부피 ÷ 10 컬럼 부피)이 100 % 가 되는지도 봅니다.

결과 확인#

• 이벤트 로그가 Column inlet connected → Column outlet connected → Temperature reached 30.0 C → Equilibration 100 % 순서입니다.
• 펌프 압력은 컬럼을 달기 전(ch03)보다 높아졌고, 온도가 오르는 동안 조금 내려갔다가 일정해졌습니다.
• 컬럼 · 온도 화면의 컬럼 카드에 방향 OK · 연결 2/2 · 30.0 C 가 표시됩니다.

단축키는 시뮬레이터 버전에 따라 바뀔 수 있습니다. <b>도움말 › 단축키 목록</b>(<kbd>?</kbd>)에서 항상 최신 목록을 확인합니다.

Python 으로 컬럼 부피와 평형 시간 구하기#

import math

# 컬럼 크기 -> 빈 관 부피, 컬럼 부피(V0), 10 컬럼 부피를 흘리는 시간
def column_volume_mL(length_mm, id_mm, porosity=0.65):
    r_cm = id_mm / 10 / 2                 # mm -> cm, 반지름
    empty = math.pi * r_cm ** 2 * (length_mm / 10)   # cm3 = mL
    return empty, empty * porosity

for L, d in [(150, 4.6), (250, 4.6), (100, 2.1)]:
    empty, v0 = column_volume_mL(L, d)
    t10 = 10 * v0 / 1.0                   # 1 mL/min 일 때 분
    print(f"{L:3d} x {d:3.1f} mm  빈 관 {empty:5.2f} mL  V0 {v0:5.2f} mL  "
          f"10 CV = {10 * v0:5.1f} mL  ({t10:4.1f} min @ 1 mL/min)")

• 2.1 mm 컬럼은 부피가 작아 1 mL/min 이면 금방 평형되지만, 실제로는 내경에 맞춰 유속도 낮춰 씁니다(대략 내경² 비율). 그 계산은 ch08 에서 다룹니다.
• 공극률 0.65 는 설명용 가정값입니다. 실제 컬럼의 V₀ 는 머무르지 않는 성분이 나오는 시간(t₀) × 유속으로 잴 수 있으며, ch07 에서 다시 씁니다.

2교시 — 검출기 설정과 베이스라인 확인#

이 단원에서 할 일#

컬럼에서 나온 성분은 검출기 플로셀을 지나며 빛을 흡수합니다. 이번 단원에서는 흡광도의 원리(비어-람베르트 법칙)를 짧게 정리하고, 램프 켜기 · 예열 → 파장 고르기 → 피크 폭 설정 → Balance → 베이스라인 확인 순서로 VWD 를 설정합니다. 마지막으로 파장을 바꿔 가며 노이즈를 비교합니다.

흡광도와 비어-람베르트 법칙#

검출기는 플로셀에 들어간 빛의 세기(I₀)와 지나온 빛의 세기(I)를 비교해 흡광도(absorbance, A) 를 계산합니다.

• A = log₁₀(I₀ / I) — 빛이 1/10 로 줄면 A = 1, 1/100 이면 A = 2 입니다. 단위는 AU(absorbance unit)이고, 크로마토그램에는 보통 mAU(1/1000 AU)로 표시합니다.
• 비어-람베르트 법칙: A = ε · b · c
  • ε — 몰 흡광 계수(L·mol⁻¹·cm⁻¹). 물질과 파장마다 다릅니다.
  • b — 광로 길이(cm). 빛이 시료를 지나는 길이, 즉 플로셀 광로 길이입니다.
  • c — 농도(mol/L).
• 흡광도는 농도에 비례합니다. 그래서 피크 면적으로 농도를 구할 수 있습니다(정량은 ch07).
• 광로가 2배면 같은 농도에서 흡광도도 2배입니다. 1260 VWD · DAD 의 표준 플로셀 광로는 10 mm 이고, 감도를 높이는 긴 광로 플로셀 · 부피를 줄인 마이크로 플로셀이 따로 있습니다(모델별 사양은 설명서 확인).

# 비어-람베르트: A = e * b * c
eps = 9740            # L/(mol cm), 273 nm 부근 카페인 몰 흡광계수 (문헌 근사값)
mw = 194.19           # g/mol, 카페인
b_cm = 1.0            # 10 mm 플로셀

for mg_L in [1, 5, 10, 20, 50]:
    c = mg_L / 1000 / mw              # mol/L
    A = eps * b_cm * c
    print(f"{mg_L:3d} mg/L -> {c * 1e6:7.2f} umol/L -> A = {A:6.4f} AU = {A * 1000:7.1f} mAU")

• 이것은 플로셀에 그 농도의 용액이 가득 찼을 때의 값입니다. 실제 피크는 컬럼에서 희석되어 꼭대기 높이가 이보다 훨씬 낮습니다.
• 흡광도가 너무 크면(대략 1 ~ 2 AU 이상) 지나온 빛이 너무 약해 직선성이 깨집니다. 이 범위는 검출기 사양을 확인합니다(확인 필요).

램프 켜기 · 예열과 사용 시간#

1260 VWD · DAD 는 중수소(D2) 램프로 자외선을 냅니다.

• 램프를 자주 껐다 켜면 수명이 줄어듭니다. 하루 안에 분석이 이어지면 켜 둡니다.
• 분석을 다 마친 날에는 끕니다. 밤새 켜 두면 사용 시간만 늘어납니다.

검출 파장 고르기#

파장은 두 가지를 함께 보고 고릅니다.

1. 분석물의 최대 흡수 파장(λmax) — 흡광도가 가장 커서 감도가 좋고, 파장이 조금 흔들려도 신호가 덜 변합니다. 예: 카페인은 273 nm 근처.
2. 이동상 용매의 UV 컷오프(UV cutoff) — 용매 자체가 빛을 많이 흡수하기 시작하는 파장. 이보다 짧은 파장에서는 바탕 흡광도가 높아 노이즈 · 드리프트가 커집니다.

• 컷오프 값은 용매 등급 · 제조사 표에 따라 조금씩 다릅니다. 사용하는 용매 병의 성적서 값을 확인합니다.
• 254 nm 는 많은 방향족 화합물이 흡수하는 "범용" 파장으로 자주 씁니다. 최적 파장은 아니지만 처음 보는 시료를 훑어볼 때 편합니다.
• ch03 에서 본 첨가제(포름산 · 아세트산 등)도 짧은 파장에서 흡수합니다. 짧은 파장을 쓸 때는 첨가제 컷오프도 확인합니다.

VWD 와 DAD 의 파장 설정#

• 정량이 목적이고 파장을 이미 알면 VWD 한 파장으로 충분합니다.
• 피크가 한 성분인지(피크 순도) 확인하거나, 처음 보는 시료의 λmax 를 찾을 때 DAD 스펙트럼이 필요합니다.

피크 폭(peak width)과 응답 시간#

검출기 설정의 피크 폭(peak width) 은 "내가 볼 가장 좁은 피크의 폭"을 알려 주는 값입니다. 장비는 이 값에 맞춰 응답 시간(response time, 신호를 평활하는 시간) 과 데이터 속도(Hz) 를 정합니다.

• 위 표는 시뮬레이터 값입니다. 실물의 선택지는 검출기 모델 · 펌웨어에 따라 다르므로 설명서의 표를 확인합니다(확인 필요).
• 응답 시간이 길면 노이즈가 줄어 베이스라인이 매끈하지만, 좁은 피크는 낮고 넓게 뭉개지고 뒤로 밀립니다.
• 응답 시간이 짧으면 피크 모양은 정확하지만 노이즈가 커지고 데이터 파일이 커집니다.
• 기준: 가장 좁은 관심 피크의 반높이 폭에 맞는 설정을 고릅니다. 실습 D 에서 직접 비교합니다.

오토 제로(Balance)와 베이스라인 확인#

Balance(오토 제로, auto zero) 는 지금의 흡광도를 0 mAU 로 다시 맞추는 기능입니다. 이동상 자체의 바탕 흡광도를 빼 주어 크로마토그램이 0 근처에서 시작하게 합니다.

• Balance 는 평형이 끝난 뒤, 분석을 시작하기 직전에 합니다. 평형 중에 하면 베이스라인이 계속 움직여 금방 다시 벗어납니다.
• Balance 는 신호를 옮길 뿐 노이즈 · 드리프트를 줄이지 않습니다.

베이스라인은 두 숫자로 판단합니다.

이 기준은 시뮬레이터가 정한 연습용 값입니다. 실물 검출기의 노이즈 · 드리프트 사양과 측정 조건은 설명서를 따릅니다.

따라하기 — 램프 켜기부터 베이스라인 확인까지#

1. 1교시에서 평형시킨 상태(30 °C, 1 mL/min, 물:메탄올 70:30)에서 시작합니다.
2. <b>모드 › 검출기 설정</b>(<kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>Shift</kbd>+<kbd>D</kbd>)을 고릅니다. 3D 뷰가 VWD 앞판으로 확대되고 A ~ D 영역이 나타납니다.
3. 램프가 꺼져 있으면 <kbd>F10</kbd> 을 누릅니다. 로그에 Lamp ignited 가 뜨고 A 영역에 예열 막대가 차오릅니다. 시뮬레이터에서 기다리는 시간을 줄이려면 <b>보기 › 시간 배속 › ×10</b>(<kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>]</kbd>)을 씁니다.
4. A 영역에서 사용 시간을 읽고, <b>검출기 설정 › 진단 › 강도 시험</b>을 눌러 결과가 Pass 인지 확인합니다.
5. 파장(B)에 254 nm 를 넣고 <kbd>Enter</kbd> 를 누릅니다.
6. 피크 폭(C)에서 >0.1 min (2 s) 를 고릅니다.
7. 예열이 끝나면(로그 Lamp warm-up complete) D 영역의 Balance 를 누르거나 <kbd>Z</kbd> 를 누릅니다. 신호가 0 mAU 근처로 옮겨집니다.
8. 10분(배속이면 1분) 동안 D 영역을 지켜보고 노이즈 · 드리프트 값을 읽습니다. ● 베이스라인 안정 이 뜨는지 확인합니다.
9. <b>파일 › 그래프 내보내기 › CSV</b>로 신호 로그를 저장합니다. 파일 이름에 파장을 넣습니다(예: baseline_254nm.csv).

결과 확인#

• 로그가 Lamp ignited → Lamp warm-up complete → Wavelength 254 nm → Balance 순서입니다.
• D 영역에 노이즈 0.1 mAU 이하, 드리프트 2 mAU/h 이하, ● 베이스라인 안정 이 보입니다.
• Balance 전 바탕 흡광도(예: 0.1 AU 안팎)가 표시되고, Balance 뒤 신호가 0 mAU 근처입니다.

Python 으로 노이즈와 드리프트 구하기#

D 영역이 하는 계산을 직접 해 봅니다. 신호를 30 s 구간으로 나눠 peak-to-peak 노이즈를 구하고, 전체 신호에 직선을 맞춰 드리프트를 구합니다.

import numpy as np

# 시뮬레이터 CSV 형식과 같은 베이스라인 (2.5 Hz, 10분)
rng = np.random.default_rng(4)
hz = 2.5
t = np.arange(0, 600, 1 / hz)                 # s
signal = 0.0003 * t + rng.normal(0, 0.008, t.size)   # mAU: 느린 기울기 + 무작위 흔들림

def noise_pp(t, y, seg_s=30):
    vals = []
    for s in np.arange(0, t[-1], seg_s):
        w = y[(t >= s) & (t < s + seg_s)]
        if w.size > 2:
            vals.append(w.max() - w.min())
    return float(np.mean(vals))

slope, intercept = np.polyfit(t, signal, 1)   # mAU / s
print(f"노이즈 (30 s 구간 p-p 평균): {noise_pp(t, signal):.3f} mAU")
print(f"드리프트: {slope * 3600:.2f} mAU/h")

• np.polyfit(t, y, 1) 은 1차식(직선) 맞춤으로 [기울기, 절편] 을 돌려줍니다. 기울기 × 3600 이 1시간당 드리프트입니다.
• p-p 노이즈는 점이 많을수록 커지는 성질이 있으므로, 비교할 때는 같은 구간 길이 · 같은 데이터 속도로 잽니다.

실습 (시뮬레이터)#

import math

length_mm, id_mm = 150, 4.6
porosity = 0.65            # 전체 공극률 (가정값)
flow_mL_min = 1.0
n_cv = 10

empty_mL = 0               # TODO: 빈 관 부피 = pi * r^2 * L  (cm 단위로 계산하면 mL)
v0_mL = 0                  # TODO: 컬럼 부피 = 빈 관 부피 * 공극률
need_mL = 0                # TODO: n_cv 배 부피
minutes = 0                # TODO: 그 부피를 흘리는 시간

print(f"빈 관 {empty_mL:.2f} mL, V0 {v0_mL:.2f} mL")
print(f"{n_cv} CV = {need_mL:.1f} mL -> {minutes:.1f} min @ {flow_mL_min} mL/min")

import math

length_mm, id_mm = 150, 4.6
porosity = 0.65
flow_mL_min = 1.0

r_cm = id_mm / 10 / 2
empty_mL = math.pi * r_cm ** 2 * (length_mm / 10)
v0_mL = empty_mL * porosity
print(f"빈 관 {empty_mL:.2f} mL, V0 {v0_mL:.2f} mL")

for n_cv in (10, 20):
    need_mL = n_cv * v0_mL
    minutes = need_mL / flow_mL_min
    print(f"{n_cv} CV = {need_mL:.1f} mL -> {minutes:.1f} min @ {flow_mL_min} mL/min")

# 빈 관 부피를 기준으로 잡는 실험실도 있습니다 (더 보수적)
print(f"(빈 관 기준 10배 = {10 * empty_mL:.1f} mL -> {10 * empty_mL / flow_mL_min:.1f} min)")

import numpy as np

inj_uL = np.array([5, 10, 20, 50])
extra_uL = 5                     # 주입마다 더 빠지는 양 (가정값)

vial_uL, dead_vial_uL = 1200, 100
insert_uL, dead_insert_uL = 150, 10

n_vial = 0     # TODO: (시료량 - 빨 수 없는 양) // (주입량 + 여분), 주입량 배열 전체에 대해
n_insert = 0   # TODO: 인서트에 대해 같은 계산

print(f"주입량 (uL): {inj_uL}")
print(f"2 mL 바이알 : {n_vial}")
print(f"인서트      : {n_insert}")

import numpy as np

inj_uL = np.array([5, 10, 20, 50])
extra_uL = 5

vial_uL, dead_vial_uL = 1200, 100
insert_uL, dead_insert_uL = 150, 10

n_vial = (vial_uL - dead_vial_uL) // (inj_uL + extra_uL)
n_insert = (insert_uL - dead_insert_uL) // (inj_uL + extra_uL)

print(f"주입량 (uL): {inj_uL}")
print(f"2 mL 바이알 : {n_vial}")
print(f"인서트      : {n_insert}")

# 시료가 150 uL 밖에 없는데 인서트 없이 2 mL 바이알에 넣으면?
print("인서트 없이 150 uL :", np.maximum((150 - dead_vial_uL) // (inj_uL + extra_uL), 0))

import numpy as np

# 파장별 베이스라인 예시 - 시뮬레이터 CSV 의 신호 열과 같은 형식 (2.5 Hz, 10분)
rng = np.random.default_rng(21)
hz = 2.5
t = np.arange(0, 600, 1 / hz)
# 파장: (Balance 전 바탕 흡광도 AU, 노이즈 크기 mAU, 드리프트 mAU/h) - 시뮬레이터 모델 값
model = {210: (0.62, 0.060, 4.0), 254: (0.05, 0.008, 0.6), 273: (0.03, 0.007, 0.5)}
logs = {}
for wl, (bg, sd, dr) in model.items():
    logs[wl] = (bg, dr / 3600 * t + rng.normal(0, sd, t.size))

def noise_pp(t, y, seg_s=30):
    # TODO: 30 s 구간마다 (최댓값 - 최솟값) 을 구해 평균을 돌려주세요
    return 0.0

def drift_per_h(t, y):
    # TODO: np.polyfit 으로 기울기(mAU/s)를 구해 1시간당 값으로 돌려주세요
    return 0.0

print("파장(nm) | 바탕 흡광도(AU) | 노이즈 p-p(mAU) | 드리프트(mAU/h) | 판정")
for wl, (bg, y) in logs.items():
    n, d = noise_pp(t, y), drift_per_h(t, y)
    ok = "안정" if (n <= 0.1 and abs(d) <= 2) else "불안정"
    print(f"{wl:8d} | {bg:15.2f} | {n:15.3f} | {d:15.2f} | {ok}")

import numpy as np

rng = np.random.default_rng(21)
hz = 2.5
t = np.arange(0, 600, 1 / hz)
model = {210: (0.62, 0.060, 4.0), 254: (0.05, 0.008, 0.6), 273: (0.03, 0.007, 0.5)}
logs = {}
for wl, (bg, sd, dr) in model.items():
    logs[wl] = (bg, dr / 3600 * t + rng.normal(0, sd, t.size))

def noise_pp(t, y, seg_s=30):
    vals = []
    for s in np.arange(0, t[-1], seg_s):
        w = y[(t >= s) & (t < s + seg_s)]
        if w.size > 2:
            vals.append(w.max() - w.min())
    return float(np.mean(vals))

def drift_per_h(t, y):
    slope, _ = np.polyfit(t, y, 1)
    return slope * 3600

print("파장(nm) | 바탕 흡광도(AU) | 노이즈 p-p(mAU) | 드리프트(mAU/h) | 판정")
for wl, (bg, y) in logs.items():
    n, d = noise_pp(t, y), drift_per_h(t, y)
    ok = "안정" if (n <= 0.1 and abs(d) <= 2) else "불안정"
    print(f"{wl:8d} | {bg:15.2f} | {n:15.3f} | {d:15.2f} | {ok}")

n210 = noise_pp(t, logs[210][1])
n273 = noise_pp(t, logs[273][1])
print(f"210 nm 노이즈는 273 nm 의 약 {n210 / n273:.0f} 배")

import numpy as np

rng = np.random.default_rng(3)
dt = 0.1                                     # s, 원 신호 간격
t = np.arange(0, 120, dt)
fwhm = 6.0                                   # s, 반높이 폭
sigma = fwhm / 2.355
true = 20 * np.exp(-0.5 * ((t - 60) / sigma) ** 2)   # mAU
raw = true + rng.normal(0, 0.15, t.size)

def lag_filter(y, tau_s):
    # TODO: out[i] = out[i-1] + a * (y[i] - out[i-1]),  a = dt / (tau_s + dt)
    return y.copy()

print("응답시간(s) | 피크 높이(mAU) | 꼭대기 시간(s) | 노이즈 SD(mAU)")
for tau in (0.5, 2, 8):
    f = lag_filter(raw, tau)
    base = f[(t > 20) & (t < 40)]            # 피크 앞 구간 = 베이스라인 (필터 시작 구간 제외)
    print(f"{tau:11.1f} | {f.max():14.2f} | {t[f.argmax()]:14.1f} | {base.std():14.3f}")

import numpy as np

rng = np.random.default_rng(3)
dt = 0.1
t = np.arange(0, 120, dt)
fwhm = 6.0
sigma = fwhm / 2.355
true = 20 * np.exp(-0.5 * ((t - 60) / sigma) ** 2)
raw = true + rng.normal(0, 0.15, t.size)

def lag_filter(y, tau_s):
    a = dt / (tau_s + dt)
    out = np.empty_like(y)
    out[0] = y[0]
    for i in range(1, y.size):
        out[i] = out[i - 1] + a * (y[i] - out[i - 1])
    return out

print("응답시간(s) | 피크 높이(mAU) | 꼭대기 시간(s) | 노이즈 SD(mAU)")
for tau in (0.5, 2, 8):
    f = lag_filter(raw, tau)
    base = f[(t > 20) & (t < 40)]
    print(f"{tau:11.1f} | {f.max():14.2f} | {t[f.argmax()]:14.1f} | {base.std():14.3f}")
print(f"참값: 높이 20.00 mAU, 꼭대기 60.0 s")

자주 나는 오류와 해결#

1) 주입했는데 피크가 작거나 들쭉날쭉함#

[Sampler] Warning: air drawn - liquid level below needle tip (vial 2)

• 원인: 바이알 시료량이 적어 니들 끝이 액면 위에 있거나, 인서트 바닥에 기포가 있어 시료 대신 공기를 빨았습니다.
• 해결: 바이알을 빼서(트레이 칸 더블클릭) 시료를 어깨 아래까지 채우거나, 시료가 적으면 인서트를 씁니다. 바이알을 선택하고 <kbd>T</kbd> 로 톡톡 쳐 기포를 올린 뒤 다시 놓습니다.

2) 니들이 바이알 바닥에 닿음#

[Sampler] Error: needle bottom contact (vial 1) - injection aborted

• 원인: 인서트를 넣었거나 바닥이 높은 바이알인데 니들 높이 오프셋이 0 입니다. 실물에서는 니들 끝이 휘거나 인서트가 깨질 수 있습니다.
• 해결: 주입 설정(B)의 니들 높이 오프셋을 올립니다(시뮬레이터 인서트 기본 권장값은 바이알 정보에 표시). 실물 값은 설명서와 인서트 규격을 확인합니다.

3) 바이알이 없다는 오류#

[Sampler] Error: no vial at position 3

• 원인: 주입 위치(또는 시퀀스의 위치 번호)에 바이알이 없습니다. 바이알을 다른 칸에 놓았을 가능성이 큽니다.
• 해결: 트레이 지도(A)에서 실제 바이알 위치를 확인하고, 바이알을 옮기거나 주입 위치를 고칩니다. 배치표와 트레이를 번호 하나씩 맞춰 봅니다.

4) 컬럼 방향 오류#

[Column] Error: flow direction reversed (C18 150 x 4.6 mm) - pump start blocked

• 원인: 컬럼 화살표가 검출기 → 열교환기 쪽을 가리킵니다.
• 해결: 펌프가 꺼진 상태에서 컬럼 출구 · 입구 연결을 풀고, 컬럼을 들어 <kbd>R</kbd> 로 뒤집은 뒤 입구 먼저 다시 연결합니다. 실물에서 거꾸로 흘린 적이 있으면 압력 · 피크 모양 변화를 기록해 담당자에게 알립니다.

5) 컬럼을 단 뒤 압력이 한계를 넘어 펌프가 멈춤#

[Pump] Pressure above upper limit (350 bar) - pump stopped
[Column] Flow ramp 0.0 -> 1.0 mL/min in 1 s

• 원인: 유속을 0 에서 한 번에 올렸거나, 컬럼 온도가 아직 낮아 이동상 점도가 큰 상태에서 높은 유속을 넣었습니다. 압력이 계속 높으면 입구 프릿 막힘일 수 있습니다.
• 해결: 0.2 → 0.5 → 1.0 mL/min 으로 단계적으로 올리고, 온도가 설정값에 닿은 뒤 압력을 판단합니다. 같은 조건에서 전보다 압력이 크게 높으면 ch09 의 막힘 진단을 봅니다.

6) 램프가 켜지지 않음#

[VWD] Lamp ignition failed (attempt 3/3)

• 원인: 시뮬레이터 시나리오에서 램프 사용 시간이 수명을 넘었거나, 앞판이 열린 상태입니다. 실물에서는 램프 노후 · 커넥터 접촉 불량 등이 원인입니다.
• 해결: 3D 뷰에서 검출기 앞판이 닫혔는지 확인하고 <kbd>F10</kbd> 으로 다시 켭니다. A 영역의 사용 시간이 2000 h 를 넘었으면 램프 교체 시나리오(ch09)로 넘어갑니다. 실물 램프는 뜨겁고 자외선을 내므로 끈 뒤 충분히 식힌 다음 다룹니다.

7) 베이스라인이 계속 흘러내리거나 노이즈가 큼#

[VWD] Baseline drift 9.8 mAU/h, noise 0.21 mAU - not stable

• 원인: (a) 램프 예열이 덜 됨, (b) 용매 컷오프 근처 파장, (c) 컬럼 평형 · 온도 미도달, (d) 플로셀에 기포.
• 해결: (a) 예열 막대가 끝날 때까지 기다림 → (b) 파장을 확인(메탄올이면 210 nm 이하 피함) → (c) 컬럼 · 온도 화면에서 Equilibration 100 % · 온도 도달 확인 → (d) 유속을 잠시 올렸다 내려 기포를 밀어냄. 하나씩 바꾸고 다시 10분 기록합니다.

과제 / 팀 미션#

참고자료#

• Agilent 1260 Infinity II LC 시스템 제품 페이지: https://www.agilent.com/en/product/liquid-chromatography/hplc-systems/analytical-hplc-systems/1260-infinity-ii-lc-system
• Agilent 1260 Infinity II Vialsampler (G7129A) · Multicolumn Thermostat (G7116A) · Variable Wavelength Detector (G7114A) User Manual — 주입량 범위 · 니들 높이 · 온도 범위 · 피크 폭 표 · 램프 예열. Agilent 문헌 라이브러리에서 모델 번호로 검색: https://www.agilent.com/en/support
• Agilent, The LC Handbook — Guide to LC Columns and Method Development (컬럼 선택 · 평형 · 검출 파장): https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/LC-Handbook-Complete-2.pdf
• 이 사이트의 도구: Python Playground · 3D 뷰어 · 3D 시뮬레이터
• 이전 차시: ch03 이동상 준비와 펌프 조작 · 다음 차시: ch05 메서드와 시퀀스 작성