CH06첫 분석: 카페인 표준물

학습 목표#

• 카페인 원액(stock)을 조제하고 C₁V₁ = C₂V₂ 로 사용 표준용액의 희석량을 계산해, 시뮬레이터의 <b>편집 › 표준용액 조제</b> 에서 블랭크 · 표준물 바이알을 준비할 수 있습니다.
• 퍼지 → 평형 → 블랭크 주입 → 표준물 주입 순서의 시스템 준비 체크리스트를 따라 첫 크로마토그램을 얻고, <b>모드 › 데이터 분석</b> 에서 확대 · 커서로 머무름 시간과 높이를 읽을 수 있습니다.
• 자동 적분 결과 표의 tR · 면적 · 높이 · 면적% 를 읽고, 적분 파라미터(기울기 감도 · 피크 폭 · 면적 거부)와 베이스라인을 고쳤을 때 결과가 어떻게 바뀌는지 설명할 수 있습니다.
• 머무름 인자(k) · 선택성(α) · 분리도(Rs) · 이론단수(N) · 대칭도(T)를 정의하고, 메탄올 비율 20 · 30 · 40 % 에서 얻은 혼합 표준물 결과로 가장 알맞은 조성을 근거를 들어 고를 수 있습니다.
• Python 으로 크로마토그램 CSV 를 불러와 사다리꼴 적분으로 면적을 계산하고, 반복 주입의 상대표준편차(RSD) 와 k · α · Rs · N 을 구하는 함수를 만들 수 있습니다.

이론#

1교시 — 카페인 표준물 분석과 적분#

이 단원에서 할 일#

ch03 ~ ch05 에서 이동상 · 펌프 · 샘플러 · 컬럼 · 검출기를 맞추고, 메서드 PRAC_ISO_W70M30_v01(C18 · 물:메탄올 70:30 · 1 mL/min · 30 °C · 273 nm · 정지 시간 10 min)을 저장했습니다. 이번 차시에서 드디어 진짜 시료를 주입합니다. 이번 단원에서는 카페인 표준용액을 직접 만들고, 시스템 준비 체크리스트를 따라 블랭크와 표준물을 주입한 뒤, 데이터 분석 화면에서 피크를 읽고 적분 결과를 확인합니다. 마지막으로 Python 으로 같은 크로마토그램 CSV 를 불러와 면적을 직접 계산하고, 3회 반복 주입의 RSD 를 구합니다.

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표준용액 만들기 — 원액과 희석#

표준물(standard) 은 농도를 정확히 아는 분석물 용액입니다. 보통 두 단계로 만듭니다.

1. 원액(stock solution): 순수한 분석물을 저울로 달아 부피 플라스크에 녹여 진한 용액을 만듭니다. 농도가 높아 무게 오차의 비율이 작습니다.
2. 사용 표준(working standard): 원액을 피펫으로 덜어 부피 플라스크에서 묽혀, 검출기가 잘 재는 농도로 맞춥니다.

희석에는 녹아 있는 물질의 양은 그대로라는 관계를 씁니다.

C₁ · V₁ = C₂ · V₂ → V₁ = C₂ · V₂ / C₁

V₁ = 50 × 10 / 1000 = 0.500 mL 입니다. 원액 0.500 mL 를 10 mL 부피 플라스크에 넣고 이동상(물:메탄올 70:30) 으로 눈금까지 채웁니다.

• 단위를 맞춥니다. mg/L 와 µg/mL 는 같은 값입니다(1000 mg/L = 1000 µg/mL = 1 mg/mL). C₁ · C₂ 단위가 같고 V₁ · V₂ 단위가 같으면 공식이 그대로 맞습니다.
• 저울에 25.0 mg 이 아니라 25.3 mg 이 찍혔다면 억지로 맞추지 말고 실제 무게로 농도를 다시 계산합니다(25.3 mg ÷ 25 mL = 1012 mg/L). 사용 표준 농도도 이 값으로 다시 계산해 기록합니다.
• 사용 표준은 가능하면 이동상과 같은 용매로 묽힙니다. 시료 용매가 이동상보다 유기용매가 훨씬 많으면(예: 100 % 메탄올) 피크가 앞쪽으로 끌리거나 갈라집니다(오류 5번).
• 0.5 mL 보다 작은 부피를 덜어야 하면 오차가 커집니다. 그럴 때는 중간 희석 용액을 한 번 더 만듭니다.

시스템 준비 체크리스트#

주입 버튼을 누르기 전에 아래 순서를 위에서부터 하나씩 확인합니다. 하나를 건너뛰면 그 뒤 결과가 모두 의심스러워집니다.

• 블랭크를 먼저 주입하는 이유는 ch05 의 시퀀스 설계와 같습니다. 블랭크에서 보이는 피크는 시료와 상관없는 바탕이므로, 나중에 표준물 · 시료에서 그 자리를 빼고 봐야 합니다.
• 블랭크에도 t₀ 부근(약 1.6 min) 에 작은 위아래 출렁임이 보입니다. 주입한 용액과 이동상이 아주 조금 달라 생기는 용매 피크(주입 교란) 로, 정상입니다. 이 시간이 바로 머무르지 않는 성분이 컬럼을 지나는 시간 t₀ 입니다(2교시에서 씀).

따라하기 — 표준용액 준비와 첫 주입#

1. <b>편집 › 표준용액 조제</b>를 고릅니다. 시약 목록에서 Caffeine, 부피 플라스크 25 mL, 용매 Water 를 고르고 무게 달기를 누릅니다. 저울 값(예: 25.3 mg)을 기록합니다.
2. 만들기를 누르면 원액 STOCK-CAF 가 생기고, 창 아래에 실제 농도(예: 1012 mg/L)가 표시됩니다.
3. 같은 창의 희석 탭에서 원액 STOCK-CAF, 만들 농도 50 mg/L, 플라스크 10 mL, 용매 이동상 A70/B30 을 넣습니다. 계산을 누르면 덜어 낼 부피(V₁)가 나옵니다. 손으로 계산한 값과 같은지 확인한 뒤 만들기를 누릅니다 → STD-CAF-50.
4. <b>편집 › 바이알 준비</b>(ch04)에서 위치 1 에 BLANK(이동상), 위치 2 에 STD-CAF-50 을 놓습니다. 액량은 1.5 mL 로 둡니다.
5. 체크리스트 ① ~ ② 를 확인합니다. <b>모드 › 실행 모니터</b>(<kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>Shift</kbd>+<kbd>R</kbd>) B 영역이 모두 ● 준비됨 이면 검출기 Balance(<kbd>Z</kbd>)를 누릅니다.
6. <b>Method › Open Method</b>(<kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>Shift</kbd>+<kbd>O</kbd>)로 PRAC_ISO_W70M30_v01 을 엽니다.
7. <b>Run › Single Run</b>(<kbd>F5</kbd>) → 위치 1, 시료 이름 BLANK-1 → 시작. 10분 동안 C 영역 실시간 크로마토그램을 지켜봅니다(<kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>]</kbd> 로 배속 가능).
8. 블랭크가 끝나면 다시 <kbd>F5</kbd> → 위치 2, 시료 이름 STD-CAF-50 → 시작. 약 5분에 큰 피크 하나가 올라오는지 봅니다.
9. 같은 바이알을 두 번 더 주입합니다(<kbd>F5</kbd> 두 번, 시료 이름은 그대로). 시뮬레이터가 파일 이름 끝에 -01, -02, -03 을 붙입니다. 반복 주입 결과는 실습 C 에서 씁니다.

데이터 분석 화면#

확대 · 커서로 머무름 시간과 높이 읽기#

1. <b>모드 › 데이터 분석</b>(<kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>Shift</kbd>+<kbd>D</kbd>)을 고릅니다.
2. A 영역에서 002-STD-CAF-50-01 을 더블클릭합니다. 파일이 안 보이면 <b>파일 › 데이터 열기</b>(<kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>O</kbd>)로 데이터 폴더를 고릅니다.
3. B 창에서 4.5 ~ 6 min, 0 ~ 180 mAU 를 감싸도록 마우스로 사각형을 끌어 확대합니다. 너무 확대했으면 <kbd>Backspace</kbd> 로 이전 확대로, <kbd>A</kbd> 로 전체 보기로 돌아갑니다.
4. <kbd>C</kbd> 를 눌러 커서를 켜고 피크 근처를 클릭합니다. <kbd>P</kbd> 를 누르면 커서가 가장 가까운 피크 꼭대기로 갑니다.
5. C 영역에서 시간 5.161 min, 신호 160.2 mAU 근처 값을 읽어 기록합니다. <kbd>←</kbd> <kbd>→</kbd> 로 한 점씩 옮기며 꼭대기가 맞는지 확인합니다.
6. 피크 바로 앞 베이스라인(약 4.6 min)을 <kbd>Shift</kbd>+클릭해 기준점으로 잡고, 다시 꼭대기로 갑니다(<kbd>P</kbd>). C 영역의 Δ신호 가 베이스라인에서 잰 피크 높이입니다.
7. 1.5 ~ 1.8 min 을 확대해 용매 피크(t₀)를 보고, 커서로 그 시간(약 1.62 min)을 기록합니다.

• 데이터 점은 2.5 Hz(0.4 s 간격, ch04 의 피크 폭 >0.1 min 설정)로 찍혀 있습니다. 커서로 읽은 꼭대기 시간은 점 간격(약 0.007 min)만큼 결과 표의 RT 와 다를 수 있습니다. 결과 표는 꼭대기 근처 점들로 곡선을 맞춰 더 정밀한 값을 냅니다.
• 높이를 커서 신호 값 그대로 읽으면 베이스라인이 0 이 아닐 때 그만큼 틀립니다. 그래서 기준점과의 차이(Δ신호) 로 읽습니다.

자동 적분 결과 표 읽기#

적분 파라미터와 베이스라인 수정#

자동 적분기는 신호의 기울기를 보고 피크 시작 · 꼭대기 · 끝을 찾습니다. E 영역(<b>Integration › Integration Events</b>, <kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>E</kbd>)에서 그 기준을 바꿉니다.

• 파라미터를 바꾼 뒤에는 <kbd>F8</kbd> 로 다시 적분해야 표가 바뀝니다. 바꾼 값은 데이터가 아니라 처리 조건에 저장되어, 같은 시퀀스의 다른 파일에도 똑같이 적용할 수 있습니다(<b>Integration › Apply to All</b>).
• 피크 폭 파라미터는 ch04 의 검출기 피크 폭 설정과 이름은 같지만 다른 값입니다. 검출기 설정은 데이터를 기록할 때 쓰이고, 적분 파라미터는 기록된 데이터를 처리할 때 쓰입니다. 보통 같은 크기(0.1 min)로 맞춥니다.
• 실물 CDS(OpenLab CDS · ChemStation 등)도 비슷한 이름의 파라미터를 쓰지만, 단위 · 기본값 · 세부 동작은 소프트웨어와 버전마다 다릅니다. 실물에서는 그 소프트웨어 설명서를 확인합니다.

자동 적분이 이상하게 그은 베이스라인은 수동 적분으로 고칠 수 있습니다.

따라하기 — 파라미터를 바꿔 가며 다시 적분하기#

1. 002-STD-CAF-50-01 을 연 상태에서 <kbd>F8</kbd> 로 자동 적분합니다. 처음에는 E 영역 시간 이벤트가 비어 있어 1.66 min 의 용매 피크도 표에 들어옵니다. 피크 수(3개)와 면적% 를 기록합니다.
2. <kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>E</kbd> 로 E 영역을 열고 시간 이벤트 표에 0.00 Integration Off, 2.00 Integration On 두 줄을 넣은 뒤 <kbd>F8</kbd> 을 누릅니다. 용매 피크가 빠지고 카페인 면적% 가 99.73 이 되는지 확인합니다.
3. 면적 거부를 10 으로 올리고 <kbd>F8</kbd> → 3.10 min 의 작은 피크(면적 4.5)가 표에서 사라집니다. 카페인 면적은 그대로이고 면적% 만 100.00 으로 바뀌는 것을 확인합니다.
4. 면적 거부를 1.0 으로 되돌리고 기울기 감도를 20 으로 올린 뒤 <kbd>F8</kbd> → 작은 피크가 사라지고 카페인 면적도 0.5 ~ 1 % 정도 줄어드는지 봅니다(피크 시작 · 끝이 안쪽으로 들어옴).
5. 기울기 감도를 1.0 으로 되돌리고 다시 적분합니다.
6. 연습으로 카페인 피크를 <kbd>Del</kbd> 로 지웠다가 <kbd>B</kbd> 로 4.90 min 에서 5.46 min 까지 베이스라인을 직접 그어 봅니다. Type 이 MM 으로 바뀌는지 확인한 뒤 <b>Integration › Manual › Undo All Manual</b> 로 되돌립니다.
7. <b>Integration › Apply to All</b> 로 같은 처리 조건을 -02, -03 파일에도 적용하고 D 표의 RT · Area 를 기록합니다(실습 C).
8. <b>파일 › 그래프 내보내기 › CSV</b>(ch04)로 -01 신호를 002-STD-CAF-50-01.csv 로 저장합니다(실습 B).

단축키 · 메뉴 정리#

단축키는 시뮬레이터 버전에 따라 바뀔 수 있습니다. <b>도움말 › 단축키 목록</b>(<kbd>?</kbd>)에서 항상 최신 목록을 확인합니다.

결과 확인#

• 블랭크(001-BLANK-1-01)에는 1.6 min 부근 용매 피크 외에 5.2 min 부근 피크가 없습니다.
• STD-CAF-50 의 카페인 피크는 **RT 약 5.16 min · 높이 약 160 mAU · 면적 약 1640 mAU*s · 반높이 폭 약 0.16 min** 이고 Type 은 BB 입니다.
• 3회 주입의 RT 는 서로 0.01 min 안쪽, 면적은 1 % 안쪽으로 비슷합니다(실습 C 에서 RSD 로 확인).

적분기는 어떻게 피크를 찾을까 — Python 으로 흉내 내기#

자동 적분기의 핵심은 "기울기가 문턱을 넘으면 피크 시작, 다시 문턱 아래로 내려와 한동안 조용하면 피크 끝" 입니다. 아래 코드는 이것을 아주 단순하게 흉내 냅니다. 기울기 감도 · 면적 거부를 바꾸면 결과 표가 어떻게 달라지는지 보세요.

import numpy as np

# 시뮬레이터 신호와 같은 모양: 2.5 Hz, 0 ~ 8 min
rng = np.random.default_rng(6)
t = np.arange(0, 8, 0.4 / 60)                       # min
y = 0.6 * np.exp(-0.5 * ((t - 3.10) / 0.05) ** 2)   # 작은 불순물
y += 160 * np.exp(-0.5 * ((t - 5.16) / 0.068) ** 2) # 카페인
y += rng.normal(0, 0.01, t.size)                     # 노이즈

def integrate(t, y, slope_sens, area_reject, smooth=5):
    ys = np.convolve(y, np.ones(smooth) / smooth, mode="same")   # 평활 (피크 폭 파라미터 역할)
    slope = np.gradient(ys, t)                                   # 기울기 mAU/min
    active = np.abs(slope) > slope_sens                          # 문턱을 넘는 점
    peaks, i = [], 0
    while i < t.size:
        if active[i]:
            j = i
            while j < t.size and active[j:j + 10].any():         # 10점 동안 조용하면 끝
                j += 1
            seg = slice(i, min(j, t.size - 1) + 1)
            tt, yy = t[seg], y[seg]
            base = np.interp(tt, [tt[0], tt[-1]], [yy[0], yy[-1]])   # 시작 - 끝 직선 베이스라인
            h = yy - base
            area = float(np.sum((h[1:] + h[:-1]) / 2 * np.diff(tt))) * 60   # mAU*s
            if area >= area_reject:
                k = int(np.argmax(h))
                peaks.append((round(float(tt[k]), 3), round(area, 1)))
            i = j + 1
        else:
            i += 1
    return peaks

for ss, ar in [(1.0, 1.0), (5.0, 1.0), (20.0, 1.0), (5.0, 10.0)]:
    print(f"기울기 감도 {ss:5.1f}, 면적 거부 {ar:5.1f} -> {integrate(t, y, ss, ar)}")

• 기울기 감도 1.0 에서는 작은 피크(3.09 min, 면적 약 4.5)와 카페인이 모두 잡힙니다.
• 5.0 으로 올리면 작은 피크의 시작 · 끝이 안쪽으로 들어와 면적이 2.6 으로 줄고, 20 에서는 아예 사라집니다. 카페인 면적도 1636 → 1625 로 약 0.7 % 줄어듭니다.
• 면적 거부 10 은 피크 찾기는 그대로 두고 표에서만 작은 피크를 뺍니다.
• 진짜 적분기는 이보다 훨씬 정교하지만(골짜기 · 어깨 피크 처리 등), "파라미터가 피크 시작 · 끝과 면적을 바꾼다" 는 원리는 같습니다.

2교시 — 이동상 조성이 분리에 주는 영향#

이 단원에서 할 일#

1교시에서는 카페인 하나만 들어 있는 표준물을 분석했습니다. 실제 시료(차 · 초콜릿 · 의약품)에는 카페인과 구조가 비슷한 테오브로민(theobromine) · 테오필린(theophylline) 이 함께 들어 있는 경우가 많습니다. 이번 단원에서는 세 물질을 섞은 혼합 표준물을 메탄올 비율 20 · 30 · 40 % 에서 분석하고, 분리를 숫자로 나타내는 k · α · Rs · N · T 를 계산해 어느 조성이 가장 알맞은지 근거를 들어 고릅니다.

크로마토그래피의 기본 숫자#

• t₀ (불감 시간, dead time) 는 머무르지 않는 성분이 나오는 시간입니다. 1교시에서 본 용매 피크 시간(약 1.62 min)을 씁니다. ch04 에서 계산한 컬럼 부피 V₀ ≈ 1.62 mL 를 유속 1 mL/min 으로 나눈 값과 같습니다.
• tR · t₀ · w 는 같은 단위(min)로 넣습니다. Rs · N · k · α · T 는 모두 단위가 없는 수입니다.
• Rs 식은 두 가지가 있습니다. 바닥 폭 w 는 피크 양쪽 변곡점에 그은 접선이 베이스라인과 만나는 폭이라 그리기가 번거롭기 때문에, 보통 결과 표의 반높이 폭 w½ 로 계산합니다(가우스 피크에서 w ≈ 1.70 w½ 이므로 2 ÷ 1.70 ≈ 1.18).
• 대칭도의 합격 기준(예: T ≤ 2.0)과 RSD 기준은 시스템 적합성으로 ch07 에서 정리합니다.

세 숫자는 분리도 식 하나로 묶입니다(퍼넬, Purnell 식).

Rs = (√N / 4) · ((α − 1) / α) · (k₂ / (1 + k₂))

• N(효율) 을 높이려면 더 긴 컬럼 · 더 작은 입자를 씁니다. 하지만 Rs 는 √N 에 비례하므로 N 을 4배로 해야 Rs 가 2배입니다.
• α(선택성) 가 Rs 에 가장 크게 듣습니다. α 가 1.05 → 1.10 이면 (α−1)/α 가 거의 2배가 됩니다. α 는 이동상 · 고정상의 종류와 조성으로 바뀝니다.
• k(머무름) 는 1 근처까지는 Rs 를 빨리 키우지만, 5 를 넘으면 k₂/(1+k₂) 가 0.83 → 0.9 정도로 거의 늘지 않고 시간만 길어집니다.

메탄올 비율과 머무름 — log k 의 직선 관계#

역상(reversed-phase) 크로마토그래피에서 이동상의 유기용매(메탄올)가 많아지면 이동상이 분석물을 더 잘 녹여, 분석물이 C18 고정상에서 더 빨리 떨어져 나옵니다. 그래서 메탄올 비율 φ(0 ~ 1)가 커질수록 k 가 작아지고, 꽤 넓은 범위에서 다음 관계가 대략 성립합니다.

log k ≈ log kw − S · φ

• kw 는 메탄올 0 %(물만) 일 때로 외삽한 k, S 는 직선의 기울기로 물질마다 다릅니다. 작은 분자는 대략 S 가 3 ~ 5 정도입니다.
• 경험 규칙: 유기용매 10 %p 를 늘리면 k 가 약 2 ~ 3배 줄어듭니다. 이 차시의 카페인은 S ≈ 3.5 라 10 %p 마다 k 가 약 2.2배 바뀝니다.
• 물질마다 S 가 다르기 때문에 조성을 바꾸면 k 만이 아니라 α 도 바뀝니다. 이번 혼합물은 메탄올이 많아질수록 테오필린 · 카페인의 α 가 1 에 가까워져 두 피크가 겹칩니다.
• 이 관계는 대략적인 직선이며 범위가 넓어지면 휘어집니다. 세 점으로 직선을 맞춰 그 사이를 짐작하는 데만 쓰고, 예측한 조건은 반드시 실제로 주입해 확인합니다. 조건을 체계적으로 찾는 방법은 ch08 에서 다룹니다.

세 물질은 모두 크산틴(xanthine) 골격에 메틸기가 붙은 분자입니다. 메틸기가 2개인 테오브로민 · 테오필린보다 3개인 카페인이 덜 극성이라 C18 에 더 오래 붙어 있어, 이 조건에서는 테오브로민 → 테오필린 → 카페인 순서로 나옵니다. 다만 순서를 구조만 보고 짐작하지 않고, 단일 표준물을 따로 주입해 RT 로 확인하는 것이 원칙입니다. 이번 차시에서는 1교시의 STD-CAF-50(RT 5.16 min)으로 카페인 피크를 확인합니다.

분리도 1.5 가 필요한 이유#

두 피크가 가우스 모양이고 크기가 비슷하다고 하면, 분리도에 따라 겹치는 정도는 대략 다음과 같습니다.

• Rs 가 1.5 보다 작으면 적분기가 두 피크 사이를 골짜기(V) 에서 나누어 Type 이 BV · VB 가 되고, 한쪽 면적이 다른 쪽으로 넘어갑니다. 같은 시료라도 적분 파라미터에 따라 면적이 흔들려 정량 결과를 믿기 어렵습니다.
• 두 피크 크기가 크게 다르면(큰 피크 옆의 작은 불순물) 1.5 로도 부족해 2.0 이상을 목표로 하기도 합니다.
• 반대로 Rs 가 필요 이상으로 크면(예: 6) 분리는 좋지만 분석 시간 · 용매가 낭비됩니다. "1.5 이상이면서 가장 짧은 조건" 이 이번 차시의 선택 기준입니다.

따라하기 — 세 가지 조성으로 혼합 표준물 분석하기#

1. <b>편집 › 표준용액 조제</b>에서 원액 세 개를 만듭니다: STOCK-CAF(1교시), STOCK-TPH(테오필린 25.0 mg / 25 mL 물, 1000 mg/L), STOCK-TBR(테오브로민 25.0 mg / 100 mL 물, 250 mg/L).
2. 혼합 희석 탭에서 세 원액을 골라 각 20 mg/L, 10 mL, 용매 이동상 A70/B30 으로 MIX-XAN 을 만듭니다. 덜어 낼 부피는 카페인 · 테오필린 각 0.200 mL, 테오브로민 0.800 mL 입니다(실습 A 에서 계산).
3. <b>편집 › 바이알 준비</b>에서 위치 3 에 MIX-XAN 을 놓습니다.
4. 메서드를 조성별로 준비합니다. PRAC_ISO_W70M30_v01 을 열고 <b>Method › Save As</b> 로 펌프 조성만 바꿔 두 개를 더 만듭니다.

1. 30 % 부터 시작합니다. PRAC_ISO_W70M30_v01 이 이미 평형되어 있으므로 <kbd>F5</kbd> → 위치 3, 이름 MIX-XAN-M30 으로 주입합니다.
2. PRAC_ISO_W80M20_v01 을 열고 <b>Method › Send to Instrument</b> 로 보낸 뒤 10 컬럼 부피(약 16 min) 이상 평형합니다. 조성이 바뀌면 베이스라인 · 압력이 함께 바뀌므로 둘 다 안정되고 B 영역이 ● 준비됨 이 되면 Balance(<kbd>Z</kbd>) → <kbd>F5</kbd> → 이름 MIX-XAN-M20.
3. 같은 방법으로 PRAC_ISO_W60M40_v01 을 보내고 평형한 뒤 MIX-XAN-M40 을 주입합니다. 기다리기 길면 배속(<kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>]</kbd>)을 씁니다.
4. <b>모드 › 데이터 분석</b>에서 세 파일을 <kbd>Ctrl</kbd>+클릭으로 고르고 <kbd>O</kbd> 로 겹쳐 봅니다. 1교시 처리 조건을 Apply to All 로 적용하고 <kbd>F8</kbd> 로 적분합니다.
5. 파일마다 D 표의 RT · Width(w½) · Type 을 기록합니다. 40 % 에서 테오필린 · 카페인이 BV · VB 로 표시되는지 봅니다.
6. 끝나면 PRAC_ISO_W70M30_v01 을 다시 보내 평형시켜 둡니다(다음 사용자 · ch07 을 위해).

결과 확인#

• 메탄올이 10 %p 늘 때마다 모든 피크가 앞당겨지고, 카페인처럼 늦게 나오는 물질일수록 더 크게 당겨집니다(S 가 큼).
• 30 % 의 카페인 RT 5.16 min 은 1교시 단일 표준물과 같습니다 → 세 번째 피크가 카페인임을 확인할 수 있습니다.
• 세 조성의 Rs · k · N 을 Python 으로 계산하는 것이 실습 D · E 입니다.

단축키 · 메뉴 정리 (2교시)#

실습 (시뮬레이터)#

def stock_conc(mass_mg, flask_mL):
    """원액 농도 (mg/L)"""
    return 0.0          # TODO 1: mg / mL 를 mg/L 로 (x 1000)

def aliquot_mL(c1, c2, v2_mL):
    """C1 V1 = C2 V2 -> V1 (mL)"""
    return 0.0          # TODO 2

stocks = {
    "CAF": stock_conc(25.3, 25),     # 카페인: 저울 25.3 mg, 25 mL
    "TPH": stock_conc(25.0, 25),     # 테오필린
    "TBR": stock_conc(25.0, 100),    # 테오브로민: 물에 잘 안 녹아 100 mL
}
print("원액 농도 (mg/L):", stocks)

v1 = aliquot_mL(stocks["CAF"], 50, 10)
print(f"STD-CAF-50: 원액 {v1:.3f} mL -> 10 mL")

# TODO 3: MIX-XAN (각 20 mg/L, 10 mL) 의 원액별 부피와 합계, 용매 부피 출력
# TODO 4: 0.1 mL 미만이면 "중간 희석 필요" 출력

def stock_conc(mass_mg, flask_mL):
    """원액 농도 (mg/L)"""
    return mass_mg / flask_mL * 1000

def aliquot_mL(c1, c2, v2_mL):
    """C1 V1 = C2 V2 -> V1 (mL)"""
    if c2 >= c1:
        raise ValueError(f"만들 농도 {c2} 가 원액 {c1:.0f} mg/L 보다 크거나 같음")
    return c2 * v2_mL / c1

stocks = {
    "CAF": stock_conc(25.3, 25),
    "TPH": stock_conc(25.0, 25),
    "TBR": stock_conc(25.0, 100),
}
print("원액 농도 (mg/L):", {k: round(v, 1) for k, v in stocks.items()})

v1 = aliquot_mL(stocks["CAF"], 50, 10)
print(f"STD-CAF-50: 원액 {v1:.3f} mL -> 10 mL")
# 피펫이 0.500 mL 고정이라면 실제 농도는?
print(f"  0.500 mL 를 넣으면 실제 {stocks['CAF'] * 0.500 / 10:.1f} mg/L")

target, v2 = 20, 10
total = 0.0
print(f"MIX-XAN (각 {target} mg/L, {v2} mL):")
for name, c1 in stocks.items():
    v = aliquot_mL(c1, target, v2)
    total += v
    note = "  <- 중간 희석 필요" if v < 0.1 else ""
    print(f"  {name}: {v:.3f} mL{note}")
print(f"  원액 합계 {total:.3f} mL, 채울 용매 약 {v2 - total:.2f} mL")
if total >= v2:
    print("  원액 합계가 플라스크 부피 이상 -> 더 큰 플라스크나 더 진한 원액 필요")

import io
import numpy as np

# ---- 시뮬레이터가 저장한 002-STD-CAF-50-01.csv 와 같은 형식의 데이터를 만듭니다 ----
rng = np.random.default_rng(21)
t = np.round(np.arange(0, 10.0001, 0.4 / 60), 4)          # 2.5 Hz
sig = np.where(t < 5.161, 160.2 * np.exp(-0.5 * ((t - 5.161) / 0.0633) ** 2),
                          160.2 * np.exp(-0.5 * ((t - 5.161) / 0.0733) ** 2))
sig += 0.6 * np.exp(-0.5 * ((t - 3.102) / 0.05) ** 2)
sig += -1.2 * np.exp(-0.5 * ((t - 1.60) / 0.02) ** 2) + 1.0 * np.exp(-0.5 * ((t - 1.66) / 0.02) ** 2)
sig += rng.normal(0, 0.01, t.size) + 0.02
lines = ["# Sample: STD-CAF-50", "# Method: PRAC_ISO_W70M30_v01",
         "# Injected: 2026-10-11 10:21:40", "# Signal: VWD1 A, 273 nm",
         "time_min,signal_mAU"]
lines += [f"{a:.4f},{b:.4f}" for a, b in zip(t, sig)]
CSV_TEXT = "\n".join(lines)
# ---------------------------------------------------------------------------

meta, rows = {}, []
for line in io.StringIO(CSV_TEXT):
    line = line.strip()
    # TODO 1: "#" 줄은 meta 에 "키: 값" 으로, 숫자 줄은 rows 에 [시간, 신호] 로 (열 이름 줄은 건너뜀)

data = np.array(rows) if rows else np.zeros((1, 2))
t, y = data[:, 0], data[:, 1]
print(meta)
print(f"점 {t.size}개")

i_top = int(np.argmax(y))
tR = t[i_top]

base_level = float(np.median(y[(t > 4.0) & (t < 4.6)])) if rows else 0.0
thr = base_level + 0.05
i0 = i1 = i_top
# TODO 2: i0 은 왼쪽으로, i1 은 오른쪽으로 y 가 thr 이하가 될 때까지 이동

tt, yy = t[i0:i1 + 1], y[i0:i1 + 1]
area = 0.0       # TODO 3: 직선 베이스라인을 빼고 사다리꼴 적분 (x 60 -> mAU*s)
height = 0.0     # TODO 4: 베이스라인을 뺀 신호의 최대값
w_half = 0.0     # TODO 4: 높이의 절반 이상인 점들의 시간 폭

print(f"tR = {tR:.3f} min, 높이 = {height:.1f} mAU, 면적 = {area:.1f} mAU*s, w1/2 = {w_half:.3f} min")

import io
import numpy as np

# ---- 시뮬레이터가 저장한 002-STD-CAF-50-01.csv 와 같은 형식의 데이터를 만듭니다 ----
rng = np.random.default_rng(21)
t = np.round(np.arange(0, 10.0001, 0.4 / 60), 4)          # 2.5 Hz
sig = np.where(t < 5.161, 160.2 * np.exp(-0.5 * ((t - 5.161) / 0.0633) ** 2),
                          160.2 * np.exp(-0.5 * ((t - 5.161) / 0.0733) ** 2))
sig += 0.6 * np.exp(-0.5 * ((t - 3.102) / 0.05) ** 2)
sig += -1.2 * np.exp(-0.5 * ((t - 1.60) / 0.02) ** 2) + 1.0 * np.exp(-0.5 * ((t - 1.66) / 0.02) ** 2)
sig += rng.normal(0, 0.01, t.size) + 0.02
lines = ["# Sample: STD-CAF-50", "# Method: PRAC_ISO_W70M30_v01",
         "# Injected: 2026-10-11 10:21:40", "# Signal: VWD1 A, 273 nm",
         "time_min,signal_mAU"]
lines += [f"{a:.4f},{b:.4f}" for a, b in zip(t, sig)]
CSV_TEXT = "\n".join(lines)
# ---------------------------------------------------------------------------

meta, rows = {}, []
for line in io.StringIO(CSV_TEXT):
    line = line.strip()
    if line.startswith("#"):                       # 머리 정보: "# 키: 값"
        key, _, val = line[1:].partition(":")
        meta[key.strip()] = val.strip()
    elif line and not line.startswith("time"):     # 열 이름 줄은 건너뜀
        rows.append([float(v) for v in line.split(",")])
data = np.array(rows)
t, y = data[:, 0], data[:, 1]
print(meta)
print(f"점 {t.size}개, {t[0]:.2f} ~ {t[-1]:.2f} min, 간격 {np.diff(t).mean() * 60:.2f} s")

i_top = int(np.argmax(y))
tR = t[i_top]

base_level = float(np.median(y[(t > 4.0) & (t < 4.6)]))
thr = base_level + 0.05                                # 바탕 + 0.05 mAU
i0 = i_top
while i0 > 0 and y[i0] > thr:
    i0 -= 1
i1 = i_top
while i1 < t.size - 1 and y[i1] > thr:
    i1 += 1

tt, yy = t[i0:i1 + 1], y[i0:i1 + 1]
base = np.interp(tt, [tt[0], tt[-1]], [yy[0], yy[-1]])   # 시작 - 끝 직선
h = yy - base
area = float(np.sum((h[1:] + h[:-1]) / 2 * np.diff(tt))) * 60   # mAU*min -> mAU*s
height = float(h.max())
above = tt[h >= height / 2]
w_half = above[-1] - above[0]

print(f"머무름 시간 tR = {tR:.3f} min")
print(f"적분 구간 {tt[0]:.3f} ~ {tt[-1]:.3f} min ({tt.size}점)")
print(f"높이 = {height:.1f} mAU, 면적 = {area:.1f} mAU*s, 반높이 폭 = {w_half:.3f} min")
print(f"시뮬레이터 결과 표 1641.8 과의 차이: {(area - 1641.8) / 1641.8 * 100:+.2f} %")

import statistics as st

runs = {
    "002-STD-CAF-50-01": {"rt": 5.161, "area": 1641.8, "height": 160.2},
    "002-STD-CAF-50-02": {"rt": 5.158, "area": 1652.3, "height": 161.0},
    "002-STD-CAF-50-03": {"rt": 5.166, "area": 1636.9, "height": 159.7},
}

def rsd(values):
    return 0.0       # TODO 1: statistics.stdev (n-1) / mean * 100

for key in ("rt", "area", "height"):
    vals = [r[key] for r in runs.values()]
    # TODO 2: 평균, 표준편차, RSD 출력
    print(key, vals, f"RSD = {rsd(vals):.2f} %")

import statistics as st

runs = {
    "002-STD-CAF-50-01": {"rt": 5.161, "area": 1641.8, "height": 160.2},
    "002-STD-CAF-50-02": {"rt": 5.158, "area": 1652.3, "height": 161.0},
    "002-STD-CAF-50-03": {"rt": 5.166, "area": 1636.9, "height": 159.7},
}

def rsd(values):
    return st.stdev(values) / st.mean(values) * 100

for key, unit in (("rt", "min"), ("area", "mAU*s"), ("height", "mAU")):
    vals = [r[key] for r in runs.values()]
    print(f"{key:6s} 평균 {st.mean(vals):9.3f} {unit:6s} SD {st.stdev(vals):7.3f}  RSD {rsd(vals):.2f} %")

# 확장: 3회째에 문제가 있었다면
bad = [1641.8, 1652.3, 1580.0]
print(f"\n3회째 면적 1580.0 이면 면적 RSD {rsd(bad):.2f} %")

# 참고: n 으로 나눈 모표준편차를 쓰면 RSD 가 작게 나옴
vals = [r["area"] for r in runs.values()]
print(f"pstdev 로 계산하면 {st.pstdev(vals) / st.mean(vals) * 100:.2f} % (반복 주입에는 stdev 사용)")

import math

def k_factor(tR, t0):
    return 0.0       # TODO 1

def selectivity(k1, k2):
    return 0.0       # TODO 2: 큰 쪽 / 작은 쪽

def resolution(t1, t2, w1, w2, half=True):
    return 0.0       # TODO 3: half 면 1.18 * dt / (w1 + w2), 아니면 2 * dt / (w1 + w2)

def plates(tR, w, half=True):
    return 0.0       # TODO 4: half 면 5.54 (tR/w)^2, 아니면 16 (tR/w)^2

def tailing(w005, f):
    return 0.0       # TODO 5

t0 = 1.62
k = k_factor(5.161, t0)
print(f"카페인 k = {k:.2f}, N = {plates(5.161, 0.161):.0f}, T = {tailing(0.304, 0.142):.2f}")

import math

def k_factor(tR, t0):
    if tR <= t0:
        raise ValueError(f"tR {tR} 가 t0 {t0} 보다 작거나 같음 - t0 를 확인")
    return (tR - t0) / t0

def selectivity(k1, k2):
    return max(k1, k2) / min(k1, k2)

def resolution(t1, t2, w1, w2, half=True):
    coef = 1.18 if half else 2.0
    return coef * abs(t2 - t1) / (w1 + w2)

def plates(tR, w, half=True):
    return (5.54 if half else 16.0) * (tR / w) ** 2

def tailing(w005, f):
    return w005 / (2 * f)

def purnell(N, alpha, k2):
    return math.sqrt(N) / 4 * (alpha - 1) / alpha * k2 / (1 + k2)

t0 = 1.62
k = k_factor(5.161, t0)
print(f"카페인 k = {k:.2f}, N = {plates(5.161, 0.161):.0f}, T = {tailing(0.304, 0.142):.2f}")

t_tph, w_tph = 4.37, 0.135
t_caf, w_caf = 5.16, 0.158
k1, k2 = k_factor(t_tph, t0), k_factor(t_caf, t0)
a = selectivity(k1, k2)
rs = resolution(t_tph, t_caf, w_tph, w_caf)
N = plates(t_caf, w_caf)
print(f"30 %: 테오필린 k {k1:.2f}, 카페인 k {k2:.2f}, alpha {a:.3f}")
print(f"  Rs (반높이 폭) = {rs:.2f}")
print(f"  Rs (퍼넬 식, N={N:.0f}) = {purnell(N, a, k2):.2f}")

# 흔한 실수: 반높이 폭을 바닥 폭 식에 넣기
print(f"  [실수] 반높이 폭을 바닥 폭 식에 넣으면 Rs = {resolution(t_tph, t_caf, w_tph, w_caf, half=False):.2f}")

import numpy as np

t0 = 1.62
names = ["테오브로민", "테오필린", "카페인"]
# 메탄올 비율: [(tR, w1/2), ...]  이름 순서대로
results = {
    20: [(5.08, 0.156), (6.97, 0.214), (9.53, 0.292)],
    30: [(3.52, 0.108), (4.37, 0.135), (5.16, 0.158)],
    40: [(2.67, 0.083), (3.03, 0.094), (3.20, 0.099)],
}

def resolution(t1, t2, w1, w2):
    return 1.18 * (t2 - t1) / (w1 + w2)

summary = {}
for pct, peaks in results.items():
    rs_list = []     # TODO 1: 이웃한 두 피크의 Rs
    last_tR = 0.0    # TODO 2: 마지막 피크 tR
    summary[pct] = (rs_list, last_tR)
    print(f"MeOH {pct} %: Rs {rs_list}, 분석 {last_tR} min")

best = None          # TODO 3: 모든 Rs >= 1.5 인 조성 중 last_tR 가 가장 작은 것
print("고른 조성:", best)

# TODO 4: log k vs phi 직선 (np.polyfit) 으로 물질별 S 구하고 35 % tR 예측

import numpy as np

t0 = 1.62
N_assumed = 6000          # 예측용: 세 조건에서 얻은 N 의 대략적인 평균
names = ["테오브로민", "테오필린", "카페인"]
results = {
    20: [(5.08, 0.156), (6.97, 0.214), (9.53, 0.292)],
    30: [(3.52, 0.108), (4.37, 0.135), (5.16, 0.158)],
    40: [(2.67, 0.083), (3.03, 0.094), (3.20, 0.099)],
}

def resolution(t1, t2, w1, w2):
    return 1.18 * (t2 - t1) / (w1 + w2)

summary = {}
for pct, peaks in results.items():
    rs_list = [round(resolution(a[0], b[0], a[1], b[1]), 2) for a, b in zip(peaks, peaks[1:])]
    last_tR = peaks[-1][0]
    ks = [(tr - t0) / t0 for tr, _ in peaks]
    Ns = [5.54 * (tr / w) ** 2 for tr, w in peaks]
    summary[pct] = (rs_list, last_tR)
    print(f"MeOH {pct} %: k {[round(k, 2) for k in ks]}, N 평균 {np.mean(Ns):.0f}, "
          f"Rs {rs_list}, 임계 Rs {min(rs_list)}, 분석 {last_tR} min")

ok = {p: v for p, v in summary.items() if min(v[0]) >= 1.5}
best = min(ok, key=lambda p: ok[p][1]) if ok else None
print("\n기준(모든 Rs >= 1.5)을 만족:", sorted(ok))
print("고른 조성:", f"MeOH {best} %" if best else "없음")

# log k = log kw - S * phi
phis = np.array(sorted(results)) / 100
pred = {}
print("\n물질별 직선 log k = log kw - S * phi")
for i, name in enumerate(names):
    logk = np.array([np.log10((results[p][i][0] - t0) / t0) for p in sorted(results)])
    slope, intercept = np.polyfit(phis, logk, 1)
    k35 = 10 ** (intercept + slope * 0.35)
    pred[name] = t0 * (1 + k35)
    print(f"  {name}: S = {-slope:.2f}, log kw = {intercept:.2f}, 35 % 예측 tR = {pred[name]:.2f} min")

tr = [pred[n] for n in names]
w = [2.355 * x / np.sqrt(N_assumed) for x in tr]
rs35 = [resolution(tr[j], tr[j + 1], w[j], w[j + 1]) for j in range(2)]
print(f"  35 % 예측 Rs = {[round(float(r), 2) for r in rs35]} (반드시 실제 주입으로 확인)")

자주 나는 오류와 해결#

1) 블랭크에 카페인 자리 피크가 나옴#

[Data] 001-BLANK-1-01: peak at 5.16 min, area 12.4 mAU*s (Blank)
[Integration] Warning: blank contains peak at analyte retention time

• 원인: 앞 주입(진한 표준물 · 원액)이 니들 · 주입 밸브에 남아 다음 주입에 섞인 잔류(carry-over) 이거나, 블랭크 바이알 · 이동상이 오염되었습니다.
• 해결: 니들 세척 방식 · 세척 바이알(ch04)을 확인하고 블랭크를 한 번 더 주입합니다. 두 번째 블랭크에서 사라지면 잔류, 그대로면 이동상 · 바이알을 새로 준비합니다. 진한 용액 다음에는 블랭크를 한 줄 넣습니다(ch05).

2) 자동 적분에서 피크를 하나도 찾지 못함#

[Integration] 0 peaks found (Slope Sensitivity 50.0, Area Reject 5000.0)

• 원인: 앞 실습에서 바꾼 기울기 감도 · 면적 거부가 너무 크게 남아 있거나, 시간 이벤트의 Integration Off 가 피크 시간을 덮고 있습니다. 다른 신호(파장)를 열었을 수도 있습니다.
• 해결: <kbd>Ctrl</kbd>+<kbd>E</kbd> 로 E 영역을 열어 파라미터를 기본값(1.0 · 0.10 · 1.0 · 0.2)으로 되돌리고, 시간 이벤트 구간을 확인한 뒤 <kbd>F8</kbd> 로 다시 적분합니다. 머리 정보의 신호 이름이 273 nm 인지 봅니다.

3) 피크 꼭대기가 평평하게 잘림#

[VWD] Warning: signal exceeds linear range (> 2000 mAU) at 5.14 - 5.19 min

• 원인: 사용 표준(50 mg/L) 대신 원액(1000 mg/L) 을 주입했거나, 주입량을 10 µL 가 아닌 100 µL 로 넣었습니다. 검출기가 잴 수 있는 범위를 넘으면 면적 · 높이가 농도에 비례하지 않습니다.
• 해결: <b>편집 › 바이알 준비</b>에서 위치 2 의 용액 이름 · 농도와 메서드 주입량을 확인하고, 올바른 용액으로 다시 주입합니다. 잘린 피크의 데이터는 쓰지 않습니다.

4) 반복 주입마다 머무름 시간이 한쪽으로 밀림#

[Data] STD-CAF-50 RT: 5.02 -> 5.10 -> 5.16 min (RSD 1.38 %)

• 원인: 조성을 바꾸거나 장비를 켠 뒤 평형이 덜 된 상태에서 주입했습니다. 컬럼 온도가 아직 오르는 중이어도 같은 모양이 나옵니다.
• 해결: 10 컬럼 부피 이상 흘리고 압력 · 온도 · 베이스라인이 안정된 뒤(B 영역 ● 준비됨) 다시 주입합니다. 연속 두 번의 RT 가 0.02 min 안으로 맞을 때부터 결과로 씁니다.

5) 카페인 피크가 앞으로 끌리거나 둘로 갈라짐#

[Integration] Peak 2 (5.08 min): tailing factor 0.72 (fronting), shoulder detected

• 원인: 사용 표준을 이동상이 아니라 메탄올 100 % 로 묽혔습니다. 주입 순간 시료 용매가 이동상보다 강해, 분석물 일부가 컬럼 입구에서 붙지 못하고 먼저 흘러갑니다. 주입량이 너무 많아도 비슷합니다.
• 해결: 시료 용매를 이동상(70:30)이나 그보다 약한 용매로 바꿔 다시 조제합니다(<b>편집 › 표준용액 조제</b> 의 용매 칸). 바꿀 수 없으면 주입량을 줄입니다.

6) Python 에서 CSV 를 숫자로 바꾸지 못함#

ValueError: could not convert string to float: '# Sample: STD-CAF-50'

• 원인: 시뮬레이터 CSV 맨 위의 # 머리 정보 줄과 열 이름 줄(time_min,signal_mAU)까지 float() 로 바꾸려 했습니다.
• 해결: 실습 B 처럼 # 줄과 열 이름 줄을 건너뛰고 숫자 줄만 읽습니다. np.loadtxt 를 쓸 때는 comments="#" 를 주고, 열 이름 줄 처리 방식(skiprows)이 numpy 버전마다 다를 수 있으니 결과 배열의 첫 줄을 꼭 출력해 확인합니다.

7) 직접 계산한 Rs · N 이 시뮬레이터와 크게 다름#

Rs (내 계산) = 5.39   /   시뮬레이터 = 3.18
N  (내 계산) = 16441  /   시뮬레이터 = 5693

• 원인: 결과 표 Width 는 반높이 폭(w½) 인데 바닥 폭 식(Rs = 2Δt / Σw, N = 16(tR/w)²)에 넣었습니다. 또는 tR 은 min, 폭은 s 로 단위를 섞었습니다.
• 해결: 반높이 폭이면 Rs = 1.18Δt / (w½₁ + w½₂), N = 5.54(tR / w½)² 를 씁니다(실습 D 의 half=True). tR · t₀ · w 를 모두 min 으로 맞춥니다.

과제 / 팀 미션#

참고자료#

• Agilent OpenLab CDS 제품 페이지 (데이터 분석 · 적분 · 보고서 개요): https://www.agilent.com/en/product/software-informatics/analytical-software-suite/chromatography-data-systems/openlab-cds
• Agilent OpenLab CDS · ChemStation Edition 데이터 분석(적분 이벤트 · 수동 적분) 설명서와 1260 Infinity II VWD (G7114A) User Manual — Agilent 문헌 라이브러리에서 제품명 · 모델 번호로 검색: https://www.agilent.com/en/support
• Agilent, The LC Handbook — Guide to LC Columns and Method Development (k · α · N · Rs, 이동상 조성과 머무름): https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/LC-Handbook-Complete-2.pdf
• L. R. Snyder, J. J. Kirkland, J. W. Dolan, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd ed., Wiley (2010) — 분리도 식 · log k 와 유기용매 비율의 관계
• USP 일반 시험법 〈621〉 Chromatography — 분리도 · 이론단수 · 대칭도(tailing factor) 정의 (최신판은 USP-NF 에서 확인)
• PubChem: 카페인 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Caffeine · 테오필린 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Theophylline · 테오브로민 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Theobromine (물성 · 용해도 · 안전 정보)
• Python 공식 문서 statistics 모듈: https://docs.python.org/3/library/statistics.html · NumPy polyfit: https://numpy.org/doc/stable/reference/generated/numpy.polyfit.html
• 이 사이트의 도구: Python Playground · 3D 뷰어 · 3D 시뮬레이터
• 이전 차시: ch05 메서드와 시퀀스 작성 · 다음 차시: ch07 정량 분석: 검량선과 시스템 적합성